cvn：请你们分析下我的疑问：本人用六孔板共转染（pAAV-IRES-hrGFP、pRC、）包装空载体腺相关细菌，转染后48小时在荧光显微镜下看，一个视野内约有80%的红色荧光。转染后第一天，收病毒。再将细菌原液感染种在六孔板内293细胞，48小时后在荧光显微镜下未见绿色荧光蛋白。
上述的过程，本人重复了三次。均未见绿色荧光蛋白。现在本人觉得疲惫。请大家帮忙分析分析。谢谢！
本人用脂质体2000转染，方法是：①转染前２４小时种板，②转染前一小时换液（用无血清的DMEM或有血清的DMEM；两种方式都用过），③转染：将三种底物各1.33μg加入250μl无血清的DMEM；再将脂质体2000加入另一250μl无血清的DMEM内，静置５分钟；混合两者，静置２０分钟。然后以点滴的方法加在六孔板内。加毕，轻轻摇晃六孔板④六小时后，再次换液（含DMEM+10%FBS）。
收病毒的方法：①转染后７２小时，用孔内的培养液将细胞吹出来，收于EP管内（２支）②将２支EP管先放入－７０度冰箱内约20分钟，再取出，放入37度水浴锅内约１０分钟。③反复冻融４次；④10，000g离心１５分，取上清液。
病毒原液感染的方法：①将六孔板内的培养液吸出，加入上述的病毒液1.5ml。②感染后第二天腺病毒包装技术，将液体吸出，换成DMEM+10%FBS；有一次感染时没有吸出原液。③感染后第二，三天，荧光显微镜下未见绿色荧光。
请你们帮忙分析一下，我的问题出在那里。
丁香园网友乱爬的蚂蚁mm认为：
pAAV-IRES-hrGFP、pRC、应该等摩尔比例转染。
丁香园网友cvn：
感谢回复，按照说明书：１０cm培养皿分别需要三种质粒各10μg，有此结论必须是等品质的。另外文献也有等体积做转染的。
急，急，从过年到目前都是白干。郁闷！！
大家讨看我的疑问在那里。郁闷！！
丁香园网友觉得：
我们用的只是三质粒共转染体系，三者在直径10CM的培养皿中加的量是含目的基因的质粒10UG，，.
丁香园网友觉得：
从你的操作看没有问题，我们做的很粗糙都可以的。
如果你的质粒肯定没问题的话需要考量细胞的弊端，以前我包腺病毒的之后用过四株293A有两株好用，然后再包AAV只有一株能出毒，为了细胞得事花了好长时间，感觉AAV对细胞的要求挺高，得先确定你得293起码能出AV，或者你找个早已证明好用得AAV系统再转你得细胞试试看看.
丁香园网友cvn：
他们用脂质体小鼠还是用乙酸钙。为什么要加１５ｕｇ，要按摩尔比吗
丁香园网友觉得：
是需要等摩尔比的
丁香园网友觉得：
公司的网站上有三质粒包装系统的具体的流程及留意事项
丁香园网友田鼠117：
cvn，你好，请问一下你的哪个问题解决了吗?我如今也在包装AAV，和你情况差不多，每次在荧光下细胞看上去都是这些，但是纯化后重新转染293细胞后，却一点都看不到，很失望.请问你有哪些好的看法吗?谢谢
丁香园网友小白菜－12－zy：
我想问一下，你只看了荧光，有没有发现病症或空斑？
我认为你这些状况问题不是出在转染上，你有80%的荧光说明载体是凋亡进入了细胞。但是第二轮无荧光说明载体转入但没有包装成病毒
然而我觉得有两种可能性：
第一：你的载体腺病毒表达系统是否有问题
第二：你的293细胞能否有问题，换一株293试一下
个人觉的契机表达系统有弊端可能性大一些
丁香园网友田鼠117：
小白菜－12－zy，谢谢你，我只是认为载体表达系统或许有问题，并不像其它人所认为有白色荧光表达就说明有病毒的合成．而至于细胞的问题需要不大，是这种的吧？
丁香园网友觉得：
如果载体腺病毒表达系统是否有问题
你细胞的活性对包装病毒影响只是巨大的，比如代数，293也有不同的种类，你的这株确定是拿来包装腺病毒的吗/
在你转染后，观察荧光腺病毒包装技术，只能表明你将要将载体转入细胞了，要看能否有病毒出来，你还得观察CPE，
我将你的方法仔细看了下，你的出病毒的时间能否太短了，说不定就快要出病毒了，你就把细胞收，收细胞时间太早了。
也有你出毒是能否少了一个步骤。
虽然你的毒是有的，再次感染，是没有一点荧光吗/说不定是滴度太低，还没有在细胞表达了，感染时为什么要将培养液吸出呢/
包装是个漫长的过程，上面的就是我个人的观点，
丁香园网友田鼠117：
小白菜－12－zy，可以问一下你是用的哪些方式纯化病毒的呢？
