病毒载体广泛应用于基因治疗、疫苗或使用溶瘤病毒治疗癌症等领域

   日期:2022-09-18     来源:网络整理    作者:佚名    浏览:82    评论:0    
核心提示:该过滤器的结构适用于病毒细胞培养上清液、微载体去除和低细胞密度悬浮细胞培养的澄清。本实验的目的是通过比较不同的过滤器来优化腺病毒血清型5(Ad5)悬浮液的澄清步骤。过滤器是我们用于5型腺病毒纯化的一次性下游处理平台的一部分[4-6]。[5]“优化腺病毒纯化工艺”应用说明,订单号:85037-558-81

引言

病毒载体广泛应用于基因诊断、疫苗或使用溶瘤病毒防治疾病等领域。重组腺病毒抗原型5载体一般成为疫苗系统使用。可以使用在悬浮细胞培养中生长的哺乳动物细胞来高效地制造这种载体。通常借助裂解细胞并传递病毒来中止该制造过程。在细胞裂解过程中也会积聚诸如HCP和DNA等许多污染物,因此,腺病毒纯化的第一个挑战性下游流程就是用于去除细胞碎片的澄清步骤。

高效的澄清步骤应该兼具较高的固体颗粒去除能力或者较高的产品收率、易于放大、并且无法保护后期下游操作装置。所有这种特征造就了一个稳健且经济高效的工艺。

®PP3是最新一代的打褶的纤维缠绕过滤器,由高等级聚丙烯纤维制成(图1)。它结合了高效的颗粒保留和卓越的总通量[1]。该过滤器一般用于细菌疫苗制造的初期澄清步骤。该过滤器的构架适用于细菌细胞培育上清液、微载体去除和低细胞体积悬浮细胞培养的澄清。独立的囊式滤器,尽可能的保证操作人员的安全。

图1:®PP3预过滤器的使用聚丙烯纤维

®2XLG是一种杀菌级的膜过滤器,由单层聚醚砜膜制成[2]。该过滤器引入非对称双层膜结构,由0.8µm预过滤层和0.2µm除菌过滤层组成。预过滤器相对较粗的厚度可有效地拦截较大的污染物(如初始采收后剩余的细胞残骸和多肽质聚集体),并避免终端过滤器频繁堵塞。因此,®2XLG非常适用于保护澄清步骤过后的初期下游处理方法,例如切向流过滤或层析方法。

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®2XLG过滤器有多种厚度和方式可供选用,可用于小规模测试(图2),也可用于大规模制造。®2XLG以经伽马辐照灭菌的囊式过滤器提供,因此特别适用于预灭菌过滤器的一次性过滤过程。

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图2:用于小规模测试的25

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目的

本实验的目的是借助比较不同的过滤器来改进腺病毒抗原型5(Ad5)悬浮液的澄清步骤。目前使用两个串联的膜过滤器进行澄清步骤。在下文中,这些过滤器被命名为“基准1”和“基准2”。

材料

所测过滤器(表1)

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腺病毒5型悬浮液:

Ad5的制造是基于HEK293细胞的感染,该细胞接种于20L工作体积的物理反应器中,并在市售的添加了4mM谷氨酰基的无抗原培养基中培养。生物反应器的接种密度为0.5×/mL,感染时的细胞密度为1.0×/mL,所使用的MOI(多重感染)为5。

感染72小时后对生物反应器内细胞进行收获。培养结束后,在Ad5收获之前,添加X-100(X100,SIGMA-,瑞士)至最后浓度为0.1%(w/w),并降低搅拌转速至1000rpm持续搅拌1分钟,促使细胞在生物反应器内裂解。同时,在物理反应器中进行抗原酶处理。在37°C,以及50U/mL的脂类酶最终产率条件下,间歇搅拌料液,孵育240分钟。过滤前,细胞培养液的浑浊度为24.6NTU。

Zero-T:一种配有工具的过滤系统

Zero-T是一种配有工具的过滤系统可用于可滤性实验和放大计算[3]。该平台带有灵活的软件构架,包括一个天平和多达4个压力传感器,以及一款先进的重点数据记录和预测工具(图3)。该平台仅需使用少量产品就能迅速分辨最佳过滤膜材和厚度组合。

图3:用于恒压可滤性实验的Zero-T装置

方法

在第一个实验中,使用三种不同的过滤器过滤Ad5悬浮液:

®PP30.45µm

®2XLG

基准1膜过滤器

在之后的第二个试验中,使用两种过滤器对®PP30.45μm过滤所得的滤液进行处理:

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®2XLG

基准2膜过滤器

使用压力容器在恒压条件下进行可滤性实验。对于每个过滤方法,记录用天平称量的滤液重量或者不同时间的入口压力,并将其存储至计算机中。将滤液收集在一个玻璃容器中。

Zero-T软件使用的放大模型源自达西定律和膜孔逐渐被堵塞的模型的组合,由下面方程式(1)定义:

V=Jo*AoP*t/1+Jo*KS*P*t(1)

V=过滤体积(mL)

Jo=每压力单位流量(ml/min*cm²*bar)

P=压力(bar)

t=过滤时间(min)

KS=所过滤产品的阻塞常数(cm²/ml)

Ao=过滤面积(cm²)

方程式(1)可再次排列为:

t/V=(KS/Ao)*t+1/Ao*P*Jo(2)

另外,总过滤能力()借助方程式(2)获取:t值较高时,1/Ao*P*Jo可忽略不计,方程式(2)可汇总为:

t/V=(KS/Ao)*t,

Vmax=Ao/KS

通过实时PCR定量腺病毒颗粒数量腺病毒包装技术,并分别使用PicoGreen和HEK293HCP分析检测DNA和HCP的杂质浓度。使用具有光谱光检验的色度计检测浑浊度。

结果

在第一个过滤方法中,使用1bar的恒定压力,对下面过滤器进行非常:®PP30.45µm、基准1过滤器(0.8/0.45µm)和®2XLG。标准化速度和总通量结果分别如图4和图5所示。

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图4:®PP30.45µm(绿色)、基准1过滤器(红色)和®2XLG(蓝色)的标准化速度。

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图5:®PP30.45µm(绿色)、基准1过滤器(红色)和®2XLG(蓝色)的总通量。

后来使用两种不同的无菌级过滤器检测经®PP30.45µm过滤后的滤液:现有的基准2过滤器(0.45/0.2µm)和®2XLG0.8/0.2µm。标准化速度和总通量结果分别如图6和图7所示。

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图6:基准2过滤器(红色)和®2XLG(蓝色)的归一化流速。

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图7:基准2过滤器(红色)和®2XLG(蓝色)的总通量。

不同滤液的预测结果可在表2中进行非常,过滤性参数(比如放大至100L)如表3所示。

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表2:从®PP30.45µm和®2XLG收集的滤液的预测检测结果。

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表3:所测不同过滤器的过滤性参数和放大至100L的数据。图7:基准2过滤器(红色)和®2XLG(蓝色)的总通量。

结论

分析化验显示产品回收率为100%,部分污染物被清除。当使用®PP30.45µm作为预过滤器以保护®2XLG下游过滤器时,与基准过滤器相比,预过滤器的体积减小5倍,无菌级过滤器的体积减小2倍。推荐用于100L生产的过滤器系列为10’’®®PP30.45µm,面积为0.4m2(图8),其次是Size9的®®2XLG,面积为0.26m2(图9)。

所推过滤技术的特点在于:

独立的一次性囊式滤器,可保证操作人员的安全

无需离心机,可避免资金投入

产品收率高

总通量高,从而促使过滤面积需求降低

流速高腺病毒包装技术,可加速过滤过程

®PP3和®2XLG过滤器是我们用于5型腺病毒纯化的一次性下游处理平台的一部分[4-6]。

更多选型推荐,欢迎点击下方图片

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参考文献

[1]“®PP3”手册,订单号:85037-547-68

[2]“®2XLG”数据表,订单号:85032-535-11

[3]“Zero-T自动过滤和放大系统”数据表,订单号:85032-542-79

[4]“使用安装在®智能台式切向流平台内的®切片盒对5型腺病毒进行超滤和透析”应用表明,订单号:85037-560-49

[5]“优化腺病毒纯化工艺”应用表明,订单号:85037-558-81

[6]赋能病毒疫苗生产,Amélie,Nick博士,Linz博士,GEN,2016年11月

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标签: pp3
 
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