表面修饰化学镀镍浸金(ENIG)印刷电路板(PCB)电极电化学检测血浆中髓过氧化物酶(MPO)

英文标题：Electrochemical detection of myeloperoxidase (MPO) in blood plasma with surface-modified electroless nickel immersion gold (ENIG) printed circuit board (PCB) electrodes

中文标题：表面修饰化学镀镍浸金(ENIG)印刷电路板(PCB)电极电化学检测血浆中髓过氧化物酶(MPO)

期刊：Biosensors and Bioelectronics

2023年影响因子：12.6

中科院SCI期刊分区 ：1区工程技术

本文影响因子：12.6

发表时间：2023-11-27

作者：Ruchira Nandeshwar , Siddharth Tallur

DOI:10.1016/j.bios.2023.115891

图1 （a)利用功能化印刷电路板(PCB)传感器进行样品采集和测试的说明。该传感器的设计方式使其可以与PalmSens Sensit智能电位器连接。(b) PCB电极功能化和修饰的工艺流程示意图。(c) PCB电极上微流控通道集成过程示意图

1.亚甲基蓝涂层减少了PCB电极的可变性

      测量每个CV伏安图的氧化和还原峰值电流，结果显示为在这些电极上重复15次CV的平均相对标准偏差(RSD)的条形图，如图2(a)所示。与对照电极(约30%)相比，涂覆10 CV循环MB的电极的RSD降低了30倍(约1%)。通过表示法，图2(b)显示了在其中一个电极上通过10个连续CV循环涂覆MB期间记录的伏安图。在这些CV伏安图中没有观察到阳离子形成的峰，这证实了没有发生MB的聚合。氧化峰电流随着每一次CV循环逐渐增大，表明越来越多的MB被吸附，导致电极表面形成了一层薄层。用亚铁氰化钾和氯化钾在涂有MB的3个电极上进行10次CV循环得到的CV伏安图如图2(c)所示。由于电沉积MB，三个电极之间的可变性大大降低。电沉积MB后，阳极和阴极峰值电流也显著增加，阳极和阴极峰值电位之间的间隔也从100 mV减少到45.5 mV，表明电极表面的电活性和电化学稳定性得到改善。在这篇文章中报道的所有进一步的实验都使用了涂有10 CV循环MB的电极。

图2 (a)与未涂覆MB的对照电极相比，涂覆MB的电极(重复15次)经过5和10 CV循环后氧化还原探针的氧化还原峰的相对标准偏差(RSD)。(b)在PCB电极上沉积MB时，在10 CV周期(电压范围¶0.5V-0.5V，扫描速率为50 mV/s)记录的伏安图。(c)记录了3个PCB电极上的CV伏安图，在(裸电极)电沉积MB之前和之后。(d)有缺陷和针孔的PCB表面的光学显微照片，显示了记录拉曼光谱的2个点。(e) PCB裸电极(未涂MB)和1点(涂MB后)的拉曼光谱。在点1处，拉曼强度很低，表明表面吸附了一层薄的MB。(f)裸PCB(未涂MB)和2点(涂MB后)的拉曼光谱。在点2处记录的光谱表明沉积了多层MB。

2.AuNP的沉积提高了PCB电极的电化学活性  

      作者使用酸功能化的MWCNTs作为支架，在mb涂层的PCB电极上生长AuNP。如图4(a)所示的FTIR光谱证实了MWCNT的羧酸功能化。与MWCNT相比，MWCNT- f的C-O拉伸峰为1162 cm^-1,C=O在1637 cm^-1至1712 cm^-1范围内，C-H拉伸峰为2925 cm^-1和2854 cm^-1,O-H拉伸峰为3448 cm^-1，显示出更高的强度。1567 cm^-1处的峰是羧酸阴离子的特征。值得注意的是，制备的MWCNTs羧酸功能化率>8%。MWCNT和MWCNT- f(功能化后)的SEM显微图如图4(b)所示。利用ImageJ软件对图像进行分析，确定纳米管的直径。MWCNT-F的直径与没有酸官能化的MWCNT相比略有增加。图4(d)显示了在MWCNT和MWCNT- f上用时序电流法生长200 s的AuNPs的SEM显微图。

      图4(e)显示了在MWCNT-F上生长不同时间(200s、400s和500s)的AuNPs的SEM显微照片。分析了图4(d)中AuNPs的大小和密度，结果如图4(f)所示。从直方图中可以观察到，虽然MWCNT和MWCNT- f的颗粒大小(以面积表示)相当，但MWCNT- f的颗粒密度(即计数数)明显更高。这是意料之中的，因为MWCNT- f比MWCNT具有更多的官能团，从而导致更多的AuNP沉积。在这些缺陷处，Au³⁺离子被还原为Au并引发成核。图4(g)所示的不同计时电流持续时间下AuNP粒度(SEM显微图中的面积)的分布表明，随着计时电流持续时间的增加，分布的扩散程度增加。这是由于AuNPs簇的形成，如图4(e)所示的显微照片所示。这些更大的簇增加了传感器表面特征的表面体积比，有助于固定更高密度的抗体。因此，AuNPs沉积在MWCNT-F上500 s，以获得传感器的最大灵敏度。时间持续时间不超过500s，以免腐蚀PCB电极。每个修饰步骤完成后，使用氧化还原探针记录电极上的CV伏安图，结果如图4(h)所示。每修改一步后，峰值电流增加，证实所有材料都成功沉积在传感器表面。

图4 (a)制备的MWCNT(标签:MWCNT)和酸功能化的MWCNT (MWCNT- f)的傅里叶变换红外(FTIR)光谱。(b) MWCNT和MWCNT- f滴铸在PCB电极上的SEM显微图。(c)酸功能化前后MWCNTs的直径分布。(d)电沉积在MWCNT和MWCNT- f上的AuNPs的SEM显微照片。(e)在MWCNT- f上电沉积的AuNPs在200s、400s和500s的SEM显微照片。(f)在MWCNT和MWCNT- f上电沉积的AuNPs的颗粒面积分布(通过对SEM显微照片的ImageJ分析获得)。(g)使用时序电流法在MWCNT-F上电沉积的AuNPs的颗粒面积分布(通过SEM显微图像的ImageJ分析获得)，时间为200s, 400s和500s。(h)每个修饰步骤后PCB电极上记录的CV伏安图，顺序如下:(1)清洁电极，(2)MB涂层后，(3)MWCNT-F(投射)后，(4)AuNP沉积后。

3.改良的PCB电极可以检测临床相关的MPO浓度

      用半胱胺、戊二醛、MPO抗体和BSA涂覆PCB/MB/MWCNT-F/AuNP电极。添加BSA是为了防止其他分析物在电极上的非特异性结合。半胱胺通过巯基键与AuNPs结合，在pH = 7时，半胱胺的氨基被质子化并带正电，吸引更多带负电的氧化还原探针离子到电极表面。这将导致CV电流的增加。为了获得检测限(LOD)和检查跨电极的可变性，测试过程在三个不同的电极上重复。将所有MPO浓度下的DPV峰值电流读数与1 ng/mL MPO浓度下的DPV峰值电流读数归一化，计算平均值和标准差(σ)。图5(b)所示的结果表明，电极之间的可变性非常低，对数线性回归拟合R² = 0.99，估计LOD = RSDblank/0.13 = 15.79 ng/mL，其中RSDblank表示空白样品的传感器响应的RSD。Hayashi等人提出的LOD公式是对具有半对数响应的传感器ICH指南的修改。对于可以用作检测不健康MPO水平的筛选设备的护理点设备，该LOD值是可以接受的，因为它远低于不健康MPO水平的典型浓度。未来，可以通过使用更自动化的涂层工艺而不是人工处理来进一步降低LOD，以进一步减少可变性。在三个不同的电极上测试每种MPO浓度。电极不重复使用，即每个电极只进行两次读数:背景读数，以及用特定浓度的MPO添加的血清样本读数。图5(c)显示了不同MPO浓度下，每个电极的代表性DPV伏安图和相应的背景读数。该图显示，样品的峰值电流(后)相对于背景峰值电流(前)的变化随着MPO浓度的增加而增加。与300 ng/mL和500 ng/mL的血清MPO浓度相比，100 ng/mL和200 ng/mL的变化要小得多。根据文献报道的MPO水平，MPO浓度分为两类，即异常MPO水平(高于200 ng/mL，即300 ng/mL和500 ng/mL)和正常MPO水平(100 ng/mL和200 ng/mL) 。该传感器能够区分商业采购的人血清中MPO的异常和正常水平，如图5(d)所示，p值为0.08，使用JMP®软件计算。

图5 (a)在PBS缓冲液中稀释不同MPO浓度的DPV伏安图，在改性PCB电极上进行测试。样品按浓度递增的顺序进行测试。“空白”表示在电极上分配任何MPO样品之前获得的读数。(b)传感器对PBS中MPO的剂量响应曲线。对于PBS中1ng /mL MPO的传感器响应，数据被归一化。(c)在稀释10倍的人血清样品中添加MPO时记录的DPV伏安图。“pre”:加入MPO样品前的背景读数，“post”:加入MPO样品后的读数(孵育时间:15分钟)。(d)传感器对商业采购的人血清样本中异常和正常MPO浓度的反应。传感器响应是峰值电流水平从“前”到“后”的变化。

      图6(a)为连接PalmSens Sensit Smart恒电位器的封装PCB传感器，该恒电位器连接到手机进行数据采集和可视化。图6(b)显示了加入微流体封装前(上)和加入微流体封装后(下)改性PCB电极的照片。金纳米花(GNF)沉积的用商业采购的人血清样品中添加的MPO对包装好的传感器进行测试。经微流控通道注入40 μL加有MPO的血清样品，足以覆盖电极的活性区域。孵育15min后，用加入足够的氧化还原探针代替去离子水冲洗被试样品，将被试样品推出。该步骤的执行方式是使通道中的所有样品都被吸收垫吸收，从而确保从测试区域中去除多余的样品。再在传感器条上加入30 μL氧化还原探针，记录DPV。每个包装的传感器只使用一次，即每个传感器只进行两次读数:包装前的背景读数，以及包装后用特定浓度的MPO加标的血清样本的读数。这两个值之间的差异被记录为传感器响应，结果如图6 (c)所示。包装的传感器可以检测人血清中MPO的异常水平(高于200 ng/mL)， p值为0.028。样品中MPO的基线水平通过ELISA测定，在处理样品的同一天进行。ELISA试剂盒得到的标准曲线如图6(d)所示，计算出从血样分离的血浆中MPO的基线浓度为73.21 ng/mL。血浆中MPO的浓度分别高于和高于样品中MPO的基线浓度:50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和300 ng/mL。因此，制备的样品中的MPO浓度分别为:73.21 ng/mL(不添加MPO)、123.21 ng/mL、173.21 ng/mL、273.21 ng/mL和373.21 ng/mL。这些样品在改良电极上进行测试，测试方案与在商业采购的血清样品中添加MPO的测试相同。每个MPO浓度在3个不同的电极上测试，电极不重复使用。记录每个电极的DPV峰值电流与背景读数的变化，结果如图6(e)所示。传感器能够区分血浆样品中MPO的异常水平(273.21 ng/mL和373.21 ng/mL)和正常水平(73.21 ng/mL、123.21 ng/mL和173.21 ng/mL)， p值为0.003。然而，与商业采购的含有MPO和PBS中制备的MPO稀释剂的血清样品的读数不同，传感器对血浆样品中MPO的响应为负，即背景的DPV峰值电流小于在传感器上添加含有MPO的血浆样品后获得的峰值电流。

                                             结论