1.本发明属于化学科技领域，具体涵盖一种解读大脑中枢特定核团单级输出网络的病毒载体以及应用。
背景技术：
2.神经环路是脑部执行一切功能的物质基础，人脑中约有10
11
个神经元通过约10
15
个突触彼此互相交错形成了立体的脑神经网络，因此，解析大脑的血管环路连接是理解脑工作模式的基础。工具病毒成为现在最高效、应用最广的神经网络示踪手段，其带有易改造、传播方向特定、可携带外源基因且大幅稳定表达等各种优势，是绘制大脑连接图谱的利器。随着分子物理学和基因靶向技术的变革，现有的神经环路标记工具库仍然被不断地扩容，但用于解析直接输出神经网络的软件病毒似乎短缺。
3.目前，高抗体的重组腺相关细菌1型(raav1)和胰腺嘧啶糖苷激酶(tk)遗传缺失的单纯疱疹病毒1型毒株h129(h129-δtk-tdt)是常用的顺向跨单级突触病毒。高抗体的raav1在顺向跨突触释放过程中，只有很少量的病毒粒子无法开启下游脑区的神经元，因此一个放大步骤是必要的，通常使用raav1-hsyn-cre(》1
×
10
13
vg/ml)。此外，高滴度的raav1-hsyn-cre会反向入侵上一级神经元的轴突末端，这促使利用raav1顺向跨单级突触系统解析大脑中枢特定核团单级输出网络不严谨。单纯疱疹病毒1型h129毒株存在轴突末端反向吸收现象，而且病毒毒力较大，这促使使用h129-δtk-tdt标记的结果不够细致，且下游脑区被标记的细胞易于病变，需要通过免疫组化染色来提高荧光强度。因此，开发低毒、严谨的解析大脑单级输出网络的病毒载体带有非常重要的意义。
技术实现要素：
4.为了解决现有技术中的不足，本发明的目在于提供一种解读大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体，该病毒无法准确地解读大脑特定核团神经元的直接输出网络。本发明运用重组腺相关病毒具备安全性高、免疫原性低、宿主范围广并且无法介导基因在动物体内大量稳定表达等优势，以其成为研究神经网络的构架与用途的契机。本发明通过基因重组提供了一种腺相关病毒载体，其借助两组开展子同时推动了在神经元的轴突末端高丰度荧光蛋白的定位，以及细胞核的荧光蛋白定位，从而屏蔽掉神经元的“过路”纤维，实现了对脑部特定核团神经元直接输出网络的准确标记。该载体在神经科学领域特别在非人灵长类神经输出网络的解读中带有很大的应用价值和行业前景。
5.为推动以上目的，本发明一个方面提供了一种解读大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体中包括重组腺病毒核心质粒；
6.重组腺病毒核心质粒中包括大约两个推进子，以及由不同推进子分别驱动的能否到达轴突末端的第一标记蛋白和无法达到细胞核的第二标记蛋白的编码基因。
7.进一步地，所述重组腺病毒核心质粒中还编码从而减少第一标记蛋白表达丰度的转录激活蛋白。
8.进一步地，所述第一标记蛋白选自与egfp、bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、、、、mkate、、、、、mplum、、、hrp任一种的整合蛋白，优选为-egfp融合蛋白。
9.进一步地，所述第二标记蛋白选自与、bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、、、、mkate、、、、、mplum、、或hrp中的任一种的融合蛋白，优选为-融合蛋白。
10.进一步地，所述第一标记蛋白的开启子与第二标记蛋白的推进子不同，其中第一标记蛋白的启动子选自、uas、或uas，第二标记蛋白的启动子选自cmv、cag、ef1α、nef1α、hsyn、α、vgat、thy1、tre、uas、gfap或。
11.进一步地，所述转录激活蛋白选自tta转录激活蛋白、gal4、lexa、qf，优选地tta转录激活蛋白的基因如seqidno.7所示。
12.进一步地，启动子如seqidno.1所示、cmv启动子如seqidno.4所示。
13.进一步地，-egfp融合蛋白的序列如seqidno.2所示。
14.进一步地，-整合蛋白的序列如seqidno.5所示。
15.本发明另一个方面提供了一种重组腺病毒核心质粒，所述重组腺病毒核心质粒中包括大约两个推进子，以及由不同推进子分别驱动的能否到达轴突末端的第一标记蛋白和无法达到细胞核的第二标记蛋白的编码基因。
16.进一步地腺病毒包装技术，所述重组腺病毒核心质粒中还包括无法增加第一标记蛋白表达丰度的转录激活蛋白。
17.本发明又一个方面提供了一种重组腺相关病毒载体，该重组腺相关病毒包括上述重组腺相关细菌核心质粒。
18.本发明再一个方面提供了上述重组腺病毒核心质粒或上述的重组腺相关病毒在血管网络标记中的应用。
19.进一步地，神经网络标记为对神经单级输出神经网络的标记。
20.本发明再一个方面提供了上述的重组腺相关病毒作为血管环路示踪病毒的应用。
21.进一步地，所述神经环路示踪为对神经单级输出神经网络进行示踪。
22.具体地，一种解读大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体的建立方式包含以下方法：
23.1)重组腺病毒核心质粒构建：该载体是在同一个重组aav基因组中依次插入启动子(seqidno.1所示)、-egfp融合蛋白(seqidno.2所示)、cw3sl转录后调控元件(seqidno.3所示)、cmv启动子(seqidno.4所示)，-融合蛋白(seqidno.5所示)、t2a连接序列(seqidno.6所示)、tta基因(seqidno.7所示)或者cw3sl转录后调控元件(seqidno.3所示)，构建重组腺相关细菌核心质粒paav---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl。
24.2)重组腺相关病毒合成途径如下：将包装raav所需的辅助质粒paav、5型小鼠型aav衣壳质粒、核心质粒paav---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl共同转染细胞，分别收集上清和沉淀，利用碘克沙醇浓度梯
度离心法制备病毒，获得重组腺相关病毒。
25.3)重组腺相关病毒应用：该病毒通过开展子驱动-egfp融合蛋白的表达，利用轴突分布的性质将egfp荧光蛋白携带至轴突末端，从而达到标记神经元轴突末端的效果；借助启动子cmv驱动核定位红色荧光蛋白-或者tta基因的表达，信号肽可使入核将血管元的细胞核标记成红色，而tta转录激活蛋白作用于推进子能够使与egfp基因高丰度表达。基于上述机理，该重组腺相关病毒可以用于解析特定核团的一级输出网络。
26.与现有技巧相比，本发明具有下面优点：
27.1、本发明运用同一个重组aav基因组中多个推进子驱动多个目的基因表达，更为准确的解读大脑单级输出神经网络。
28.2、本发明解决了raav1顺向跨单级突触系统不严谨、h129逆向标记或者毒性较大的应用范围限制，避免了普通的raav9标记过路纤维的缺陷。
29.3、本发明运用了tre-tta信号放大系统及其定位功能可使egfp蛋白高丰度的表达在血管元轴突末端，避免了普通raav9标记神经元随着轴突延伸信号逐步递减的现象。
30.4、本发明还可结合神经细胞特异性启动子，用于特定类别神经元单级输出神经网络的研究。
31.5、本发明在哺乳动物特定脑区的特定类别神经元单级输出神经网络、环路功能研究等方面具备广泛的应用价值和前景。
32.6、本发明在运用腺相关细菌进行基因诊断中多基因递送方面具备潜在的应用价值。
附图说明
33.图1解析大脑单级输出神经网络的腺相关细菌载体以及工作机理示意图。
34.图2为raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl病毒与对照病毒raav9-ef1α-egfp-wpre-pa感染运动皮层的结果，其中a图中m1的细胞被raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl标记成了蓝色，图a’中m1的细胞被raav9-ef1α-egfp-wpre-pa标记成红色。图b和c是在m1注射raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl病毒的部分纤维分布展示，图b’和c’是在m1注射raav9-ef1α-egfp-wpre-pa病毒与b和c对应大脑区域的纤维分布展示，a、a’、b、b’、c、c’、d、d’、e、e’、f、f’分别是cc、不同位置的cpu、apt、zi、cp脑区放大图。用raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl标记的神经元仅局限在中部cpu(c图)、apt(d图)有纤维分布，而经典常用的病毒raav9-ef1α-egfp-wpre-pa标记神经元蓝色荧光不仅在中部cpu(c图)、apt(d图)出现，在cc(a’图)、背部cpu(b’图)、zi(e’图)、cp(f’图)也是分布腺病毒包装技术，在cc、背部cpu、zi、cp出现的红色荧光仅是m1神经元投射到下游脑区轴突路过而形成的荧光蛋白遗留现象，实际m1神经元对这种脑区并不存在投射。以上结果证实raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl可以准确的解读大脑单级输出神经网络，并解决以前工具标记过路纤维的缺陷。
具体实施手段
35.为了使本发明的上述目的、特征和特点就能变得显著易懂，下面对本发明的确切推行方法做具体的表明，但不能理解为对本发明的可实行范围的限定。
36.本发明所述技术方案，如未非常说明，均为本领域的常规技术。
37.实施例1：paav---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl载体建立与重组腺相关病毒raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl的制备。
38.paav---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl载体是在aav载体转染的itr之间依次插入启动子(seqidno.1所示)、-egfp融合蛋白基因(seqidno.2所示)、cw3sl转录后调控元件(seqidno.3所示)、cmv启动子(seqidno.4所示)，-融合蛋白基因(seqidno.5所示)、t2a连接序列(seqidno.6所示)、tta基因(seqidno.7所示)或者cw3sl转录后调控元件(seqidno.3所示)，该载体的构筑委托上海擎科生物技术有限公司完成。为了提升raav包装并且感染效率，选取了包装容量较大的aav5血清型成为包装血清型。采用特色的三核酸包装腺相关细菌的方式，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度强度离心法进行浓缩和制备，最后用sybrgreenqpcr法测定重组腺相关细菌滴度，最终获得raav---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl病毒的滴度为1.14
×
10
12
vg/ml。
39.seqidno.1：315bp
40.
41.seqidno.2：549aa
42.*
43.seqidno.3：432bp
44.
-t2a-tta-cw3sl标记的神经元仅局限在中部cpu(c图)、apt(d图)有纤维分布，而经典常用的病毒raav9-ef1α-egfp-wpre-pa标记神经元蓝色荧光不仅在中部cpu(c图)、apt(d图)出现，在cc(a’图)、背部cpu(b’图)、zi(e’图)、cp(f’图)也是分布，在cc、背部cpu、zi、cp出现的红色荧光仅是m1神经元投射到下游脑区轴突路过而形成的荧光蛋白遗留现象，实际m1神经元对这种脑区并不存在投射。以上结果证实raav5---egfp-cw3sl-cmv---t2a-tta-cw3sl可以准确的解读大脑单级输出神经网络，并解决以前工具标记过路纤维的缺陷。
