汉恒重组腺病毒操作手册目录安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项

汉恒重组腺病毒操作指南目录腺病毒安全使用和留意事项腺病毒储存与稀释的留意事项一、整体实验步骤二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒抗体（PFU）的检测五、重组腺病毒传染目的细胞六、重组腺病毒用于植物试验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒传染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种真菌感染目的细胞比较汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南腺病毒安全使用和留意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*相当重要！！！*）1)腺病毒相关试验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。2)操作病毒时请穿实验服腺病毒包装技术，佩戴头套和帽子，尽量不要裸露双腿及四肢的脸部。3)操作病毒时必须非常警惕病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立刻用70%乙醇加1%的SDS溶液擦洗干净。4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。5)如实验过程中必须离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。6)病毒相关的废弃物必须特殊收集，统一经高温灭菌后处置。7)实验完毕后请用肥皂擦洗双手。➢腺病毒储存与稀释的留意事项1）腺病毒的储存收到细菌液后若在短期内使用，可将病毒存放于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需大量储存请分装后存放于-80℃。

注：汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南a.反复冻融会增加细菌滴度（每次冻融会使细菌滴度增加10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量减少反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装（200μl/tube），收到后请直接存放-80℃冰箱保存即可。b.若病毒储存时间达到6个月，汉恒生物建议在使用前再次检测病毒抗体（参见附表2-慢病毒抗体检测方式）。2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出放在冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响细菌感染)混匀分装后放入4℃保存(一周内使用完最佳)。重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因诊断、基础生命科学探究等领域被广泛应用。重组腺病毒具备下述几个明显特点：感染范围广腺病毒包装技术，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和个别组织；感染效率高达100%，可全面超越其它细菌载体工具和脂类体自噬；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具备潜力的基因递送工具。目前常见的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。

腺病毒可借助自身的纤维（fiber）和细胞表层的自噬结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会导致细胞致死从而释放出细菌粒子。目前最常见的腺病毒包装模式有和AdMAX两种，其一同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个平台均带有腺病毒初期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1,ΔE3)，其中E3基因对病毒造成并非必需。因此，腺病毒包装汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。相对于平台，AdMAX系统操作方便，并且可以获取更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统，该平台由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体(delta)E1,3Cre双载体组成。一、整体实验步骤二、实验材料该病毒包装系统为两质粒系统，组作为穿梭质粒（pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类别）和骨架质粒（(delta)E1,3Cre)。

1、载体信息（见附1）汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南2、菌株：大肠杆菌菌种DH5α。用于测序腺病毒载体和腺病毒骨架载体转染。3、细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培育生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM+10%FBS+双抗（DMEM完全培养基）。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特点。该细胞株对于高细胞体积很脆弱，当细胞超过70%汇合时，一些细胞也许会丢失他们的表型。若细胞浓度大幅在70%以下，则293A细胞能连续培养3～4个月保持原有的细胞特性。若以购买受到的293A作为第一代，则30代内都能受到最佳结果。随着传代数量的增加，293A细胞会发生生长状况变差、突变等现象。为了避免这种现象的发生，我们必须在初始阶段对细胞进行长期的冻存保种，以确保实验的稳定性和大幅性。在细胞对数生长期进行冻存，可降低细胞复苏成活率。注：为了超过最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的抗支原体试剂。三、腺病毒包装和浓缩（一）质粒构建和测序构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过长期抽提，浓度要求高于1g/l，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。

推荐使用大抽试剂盒进行质粒的长期去内毒素抽提（核酸质量会极大制约后续转染效率和细菌的效价）。汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南注：质粒构建推荐使用汉恒生物HB-无缝克隆试剂盒。（二）腺病毒包装事先打算好用于包装病毒的293A细胞（50-70%的汇合度）和细菌菌株，转染每个直径为6cm的培养皿成分如下：pHBAd系列穿梭质粒2μ(delta)E1,3Cre4μgDMEM需在37℃水浴中预热，转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使用前摇匀。转染6h后置换成新鲜培养液。注：1、转染试剂为汉恒生物产品，使用表明参考说明书。2、转染前细胞需要进入良好的生长状况。（三）病毒收集病毒收集前要观察病毒空斑是否产生。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地产生，通常在培养液中加入低温度琼脂糖，转染后通常在第10至21天可以在显微镜下发现小的空斑。如果穿梭质粒含有荧光蛋白（GFP或RFP），则在空斑产生之前观察荧光，以确认转染效率。

空斑产生后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南空斑示意图注：高浓度的低温度琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用开水浴完全凝固，然后自然降温到45℃待用。用37℃预热的完全培养基稀释5%的肉汤糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到除去培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。6孔板每孔覆盖3ml琼脂糖/培养基。（四）病毒扩增第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行细菌少量扩增。至细胞重新出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒传染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的长期扩增，待空斑产生后搜集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。注：1、收集细胞的之后通常使用细胞刮，不能用胰酶消化，4℃500g离心10min，去除大部分上清，只留取2ml上清重悬细胞沉淀进行-80℃（干冰或者液氮均可）冻融。

2、37℃冻融时如果病毒融化就立刻取出，长时间在37℃温育会下降病毒抗体，完全凝固后可以剧烈反弹30s。冻融周期一般会大幅2~4次才可以拿到高滴度的细菌。3、细胞冻融结束裂解液可以4℃500×g离心10min，不及时使用的话可以冻存在-20℃或-80℃。汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南（五）病毒纯化病毒纯化采用沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如下:1、融化：提前1天将病毒从-80℃冰箱拿出，室温水浴融化。收集全部细胞裂解物，7000×g4℃离心10min，弃细胞碎片，收集上清。2、沉淀：每100ml上清加入50ml（20%，2.5MNaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适度延长时间）。7000×g4℃离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml浓度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20mMTris-HCl，PH8.0）（溶液配置见下表），病毒液应呈粉紫色。

三种不同浓度CsCl溶液的配制密度（g/ml）含量（mg/ml）CsCl的量（g）终体积（ml）(20℃)1.40548.35..30402.44..10143.81.、CsCl梯度离心：CsCl梯度的合成方式如下：加入2ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液（碱液同上），然后再缓慢加入3ml浓度为1.30g/ml的CsCl溶液（配置如下表），再加入5ml的病毒悬浮液。使用SW28转子，26,000rpm，4℃离心2小时。汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南4、收集病毒：用注射器收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中。注：透析袋使用前用10mMEDTA-Na煮沸10min，降至温度使用。25、透析：在透析缓冲液（50g蔗糖，10ml1MTris-HCl，PH8.0，2ml1MMgCl2定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需替换一次透析液。收集病毒，测定病毒抗体。

6、重悬：500μlPBS重悬病毒沉淀，一周内使用则放在4℃保存，如需长时间保存需放在-80℃保存。四、测定腺病毒抗体（PFU）空斑()是细菌诱导的细胞裂解产生的片状物，可以借助显微镜和肉眼观察。空斑产生单位(-unit,PFU)是单位密度的病毒产生的空斑数，是代表有活性的细菌粒子的含量单位。PFU测定方式如下：293细胞铺于60mmdish，24h后细胞浓度接近100%后加入不同稀释度的病毒，37℃汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南感染4~8h后，铺8ml低熔点胶（10%FBS，1.25%）。培养9~11天后对空斑进行计数来计算腺病毒抗体。注：腺病毒抗体还可以通过探测荧光蛋白（若有）以及借助目的基因的WB、免疫荧光或免疫组化等方式检测。五、感染目的细胞由于不同细胞的MOI不同，所以在即将实验前，需设计预试验以确认目的细胞中加入的病毒数。注：MOI值:MOI是of的简写，中文译为感染复数,实际的涵义即为每位细胞被多少个有活力病毒颗粒所感染。

不同实验室、不同操作技巧及不同细胞系条件下所对应的细胞最佳MOI都是不同的，在即将实验之前极力建议试验操作者进行一次探索最佳MOI的预试验。（一）细胞准备5将状况良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞密度约为1×10/ml。注：接种细胞总量因细胞的生长速率而略有不同，一般是确保第二天进行细菌感染的之后细胞汇合率在50%至70%之间。（二）细菌感染细胞（腺病毒传染细胞系的话可以略过纯化操作方法）感染之前，请根据梯度稀释病毒（附2），一般感染时MOI控制在3~1000区间范围。1、感染贴壁细胞汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南感染试验分为两组，分别添加带目的基因的腺病毒和等抗体同密度的对照病毒，常用孔板参数如下表（简而言之，就是把一定体积的病毒直接加入到完全培养基中就能）。加入的病毒量范围在MOI=3～1000，一般设定MOI摸索梯度为3，10，30，100，300，1000（详见附2）。每个MOI值加两个孔，4~8h后替换成新鲜完全培养基。举例：假如收到的病毒效价为5/ml,首先用完全培养基稀释到5/ml（1：51010稀释）。

这次要感染细胞数110/孔一个孔，MOI=1000，则应该510PFU/ml病毒的51010体积=1101000/510ml=2l。直接吸取2l的510PFU/ml病毒混入孔板的培养基中就能。混匀后再次培养4-8hr后替换新鲜的完全培养基。48-72hr可以观察荧光、WB等实验。注：遗弃的废液按照病毒废液来处理！腺病毒小体积感染表培养皿类型表面积/cm2培养基体积腺病毒体积96-well0.3µl0.1-0.5µl24-well2µl1-3µl12-well4cm21ml2-5µl6-cm22ml5-20µl2、感染悬浮细胞感染悬浮或半悬浮细胞，则应该通过平角离心转染法，即将适量的细菌液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（200×g）离心1h，然后放在培养箱中正常培养即可。若实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管替代，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入过量的细菌液，室温存放15min（不要达到30汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南min），然后将细胞和细菌液同时吸出转入培养皿中继续培养，感染过夜后换液即可。

（三）观察感染状况感染48~72h后，可开始观察到GFP/RFP的表达；也可借助qPCR和WB验证目的基因在基因水平和蛋白水平的表达状况。六、动物试验（动物实验需要使用纯化的腺病毒，以血清尾静脉注射为例表明）910将纯化过的腺病毒以每只小鼠5×10~1×10个病毒颗粒数注射，例如纯化腺病毒的效价为1×1011pfu/ml，则每只小鼠所需的细菌原液体积为50~100μ。具体的注射量需要进行试验探索。注：小鼠尾静脉注射体积通常固定为100l，最多不要达到200l。注射用量过多，小鼠容易出现充血性疾病。若要进行其它病毒方面的植物试验可与汉恒生物植物试验项目师交谈交流。汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南附1：汉恒生物腺病毒载体载体名称功能启动子容量荧光标记pHBAd-EF1-MCS-CMV-EGFP过表达EF15/-U6-CMV-MCS过表达/干扰5kb无VpHBAd-MCMV-MCS-CMV-RF过表达MCMV5pHBAd-MCMV-MCS-CMV-Lu过表达MCMV5pHBAd-EF1-crRNA-CMV-EG环状RNA过表达EF15-U6-CMV-GFP干扰-U6-CMV-RFP干扰/gRNA敲pHBAd-CMV-Cas9-U6-无除pHBAd-EF1-cas9-CMV-敲除EF1-U6-gRNA-敲除注：MCMV为血清巨细胞真菌的启动子，具有广谱表达活性。

汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南附2：腺病毒传染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）注：MOI值:MOI是of的简写，中文译为感染复数,实际的涵义即为每位细胞被多少个有魅力病毒所传染。不同的实验室、不同的操作技巧、不同的细胞系对应的最佳MOI都是不同的，在即将实验之前建议试验操作者进行一次探索最佳MOI的预试验。5Day0：将生长状况良好的目的细胞消化计数后稀释至1×0/ml,加入96孔板，1004μl/孔(1×10个细胞)。放入37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。Day1:在EP管中配制6个梯度MOI的病毒培养液（都稀释到100μl完全培养基），取值MOI=3，10，30，100，300，1000。然后把稀释好的细菌和细胞孵育4-8h，吸去带有细菌的培养液，在每个孔中再加入100μl完全培养液。Day3：显微镜观察荧光。此时按照荧光细胞的比率计算合适的MOI进行即将实验。注：如果病毒不表达荧光，还可以借助目的基因的qPCR、WB、免疫荧光、免疫组化等方式探索最佳MOI.汉恒腺病毒载体打造及包装操作指南附3：汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒逆转录病毒腺病毒传染方式直接加入换液时间感染后24h感染后4-8h需要筛选获得稳定感染株，慢病毒的传染不应该，腺病毒感是否应该筛选能力不强染能力很强具有GFP等荧光标签，48-72h后可以观察到表达；若不带荧观察时间光标签，则必须qPCR、WB、免疫荧光或者免疫组化等方式鉴定有时必须，但是按照详细状况操作，因为助转剂，如，是否应该助转剂对细胞的攻击非常大，有的细胞也许承受不了