分子体外检测中的原材料主要包含两个方面,一是以酶、引物、探针和Mg离子、dNTP组成的反应原材料,另外一个重要的构成虽不直接参与特异性扩增反应过程,但也有分子试剂中必不可少的个别,那就是质控品。
假病毒,是常用于分子产品阴阳性质控品以及参考品的原料。但是针对腺病毒、腺相关细菌、慢病毒、噬菌体假病毒又该如何选择呢。本文主要介绍常见的慢病毒和噬菌体假病毒。
慢病毒(,LV)
慢病毒载体结构
HIV-1的基因结构是慢病毒载体的基础
慢病毒的典型形态
HIV-1病毒基因组是由两条正链的RNA构成,长度约为9Kb左右,两端是长末端重复序列(LTR),两个LTR之间的序列为编码蛋白的序列,由9个基因(Gag基因、Pol基因、Env基因、Tat基因、Rev基因、Nef基因、Vpr基因、Vpu基因和Vif基因)构成。
HIV-1的基因结构
根据编码的蛋白类型,可以将上述基因分成三类
1.编码细菌结构蛋白的基因:gag、pol和env。gag基因编码细菌的核心蛋白如核衣壳蛋白、内膜蛋白和衣壳蛋白;pol基因编码细菌复制相关的酶;env基因编码细菌包膜糖蛋白。
2.编码调节蛋白的基因:tat、rev。rev主要参与蛋白调节的表达水平,tat参与蛋白转录的控制,与病毒的长末端重复序列(long,LTRS)结合后推动病毒的所有基因的转录。
3.编码辅助蛋白的基因:vif、vpr、vpu、nef。在HIV-1的基因组结构上,还带有病毒生命史所必须的其它序列构架,例如病毒复制和包装等所必须的信号等。
慢病毒载体则是以慢病毒基因组为基础腺病毒包装技术,对慢病毒自身的元件,如LTR、Gag、Pol等进行改造而发展出来的一类能够携带外源基因的细菌载体。
根据其来源主要也有下面几种类型
▸HIV-1型(humanvirustype1)载体系统,
▸HIV-2型(humanvirustype2)载体系统,
▸猿类免疫缺陷病毒(virus,SIV),
▸猫免疫缺陷病毒(virus,FIV)等,
其中HIV-1型载体平台应用得最为广泛。
慢病毒载体的设计
1.两质粒系统
以HIV-1为骨架,将其中的反式作用蛋白基因序列去除,然后包装作为带有目标基因的重组质粒和无法反式提供细菌颗粒所需蛋白的包装质粒,共转染包装细胞(如293T细胞)进行包装。两质粒系统为复制缺陷型载体,仅能获得较低的滴度,且仅能感染CD4+的靶细胞,并存在造成HIV的感染风险。
2.三质粒系统
将HIV-1基因组中负责包装,逆转录和融合所必须的顺式作用序列构架和编码反式作用蛋白的序列分离,再克隆到三个独立的质粒中,并去除了所有的辅助序列。极大地提高了病毒的安全性,是现在非常常见的慢病毒包装系统。
3.四质粒系统
四系统也有现在较为常见的病毒系统。与三质粒系统相比,第一个差异是将rev基因放在一个单独的表达质粒上,新增一个质粒更降低了平台的安全性。第二个差异是将tat基因去除,并在载体质粒上充满了与异源启动子融合的嵌合5'LTR,以推进载体质粒的表达。这样就产生了四个质粒的平台,即pGag/Pol、pRev、pVSV-G。此外,还有一个可以放置目的基因序列的载体。
四质粒HIV-1病毒包装系统
慢病毒的特点
1.有更广泛的宿主,对于分裂和非分裂细胞均带有感染能力。
2.稳定表达。慢病毒可以将外源基因有效的融合到细胞染色体中,且目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力,可以在靶细胞中受到大幅高效稳定的表达。
3.经过完善后的慢病毒载体可以携带至少5kb。
噬菌体假病毒
也称为装甲病毒
MS2噬菌体结构
MS2噬菌体
大肠杆菌MS2噬菌体是二十面体的单链正义RNA病毒,可传染大肠杆菌和肠球菌科的其它成员。MS2噬菌体属于轻巧病毒()家族的成员,其中包含噬菌体f2、噬菌体Qβ、噬菌体R17和噬菌体GA。
MS2基因组是已知的最小基因组之一,由3569个单链RNA核苷酸构成。它仅编码四种蛋白:成熟蛋白(A蛋白)腺病毒包装技术,裂解蛋白,外壳蛋白和复制酶蛋白。
编码裂解蛋白(lys)的基因与上游基因(cp)的3'末端和下游基因(rep)的5'末端都重叠。正义RNA基因组起信使RNA的作用,并在寄主细胞内被细菌解壳后进行翻译。尽管这四种蛋白质是由同样的信使/病毒RNA编码的,但他们只是全部以相似的水准表达;这种蛋白质的表达受翻译和RNA二级结构之间复杂的互相作用调控。
假病毒设计
假病毒包装的过程:目的基因的合成→装甲病毒(假病毒)载体的打造→装甲病毒(假病毒)包装纯化→装甲病毒(假病毒)滴度测定。
假病毒特点
MS2噬菌体外壳蛋白包裹外源抗原片段,无传染性,无自主复制能力,生物安全性高,核酸稳定,不易降解。
两种病毒的比较