概念：细胞和基因诊断（CellandGene，简称CGT，不包含未经基因修饰的干细胞等广义的细胞疗法），是一种运用基因治疗载体将外源的治疗性基因转导至细胞，再借助外源遗传的转录和翻译，改变细胞原有遗传表达以治愈癌症的方式。
发展现状
图1全球基因治疗发展历程全览
基因治疗刚需强烈，适应症以单基因遗传病（罕见病）为主，这类肿瘤的致癌基因明确，同时缺少有效的治疗方法，面临很大的未满足临床需求。2015年，中国罕见病患者数量1680万，2020年增至2000万人。然而，超过90%的少见病缺少有效的根治方法。
现在获批的基因诊断产品集中在少见病领域。从2012年至2021年，FDA批准了2款产品，均基于腺相关病AAV载体。EMA批准了6款产品（2款是FDA先批准）。除了FDA正式同意的上述两款产品，还有2012年获批的公司的产品，也是基于AAV载体，是EMA批准的首款基因治疗产品，用于防治脂蛋白脂肪酶缺失症LPLD。国内基因增补科技的在研管线，我们看到，产品基本为体内方法，且基于AAV载体，仅本导基因基于LV平台有相关管线。
表1当前获批上市的基因增补产品
表2国内的基因增补产品管线
现在，数百项关于rAAV载体的实验现在正在进行中、正在审查中或即将完成。
图22021Q2-2022Q2全球在研基因诊断临床实验状况（来源：）
关于腺相关病毒载体AAV
AAV是微小病毒科家族成员之一腺病毒包装技术，是一类能够自主复制、无被膜的20面体微小病毒，其长度仅18-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA成为基因组。临床运用的重组腺相关细菌载体（adeno-virus,rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体。
图3野生型与重组型AAV基因组结构示意图
AAV核心优势：安全性，不融合宿主基因组，靶向组织特异性。AAV是现在最安全的病毒载体，免疫原性低，非致病性。因为AAV缺乏独立复制能力，只有当辅助病毒（腺病毒、单纯疱疹病毒）存在时能够复制、感染并裂解宿主细胞，否则只能达到溶源性潜伏感染（传染宿主细胞并潜伏，但不会裂解宿主细胞）。
开发工艺
病毒载体的制造涉及多项工艺，步骤繁杂。病毒载体生产的上游（USP）主要包含病毒构建（小鼠）和细胞转染培养，下游（DSP）则包含细胞裂解、澄清、浓缩、洗滤、层析纯化、精制及杀菌过滤等多项工艺。
图4病毒载体的制造工艺
上游开发工艺
rAAV最常见的制造方法是经典的细胞/三核酸共转染系统（-freeAAV包装系统）。由于AAV缺乏独立复制能力，需要在辅助病毒存在的状况下，才能增殖子代病毒。但制造合成过程中，难以消除辅助病毒颗粒，造成细胞遗传毒性。因此现在，重组rAAV的制造不采取辅助病毒，而是运用质粒。经典的细胞/三核酸共转染系统，通过将3个底物共转染到细胞中，然后从细胞裂解物和培育基中分离纯化AAV。rAAV的三质粒系统：包含目的基因GOI的质粒，与复制REP和衣壳CAP有关的AAV血清型质粒，以及AAV辅助质粒（提供从腺病毒中分离的辅助基因）。
细胞/三核酸共转染系统优缺点
优点：是只应该建立含目的序列的rAAV质粒和普通的自噬过程，快速、简便、病毒空壳率相对低，是自该原则发明以来使用最广泛的rAAV生产模式。
缺点：是因为是基于贴壁细胞基础上的制造，细胞扩大化生产会有较大困难腺病毒包装技术，目前已有模化临床应用的制造运用驯化出悬浮培养的293细胞，作三核酸共转染生产。这种合成途径必须制备大量高品质的载体质粒，rAAV的总量在巨大程度上取决于转染的效率。
病毒载体生产的上游（USP）难点
质粒是AAV的主要成本来源，如何避免瞬时转染所需的菌株数量或者增加转染效率；如何提升细胞培育密度，扩大产量。正是因为病毒载体的工艺研发难度大，国内具有良好病毒经验、工艺背景和丰富生产管控经验的复合型人才极其稀缺。
下游开发工艺
下游加工从细胞或培育基收获开始。各种封装系统中杂质的多样性对纯化策略至关重要/经过破碎澄清后的粗提物中包括rAAV载体、细胞宿主碎片、蛋白质、基因组DNA、血清蛋白、培养基的部分成分、辅助DNA或辅助病毒等成份。这些杂质可能毒害细胞，降低转导效率，甚至导致身体免疫反应或病变反应。与其它重组蛋白药物一样，临床级rAAV载体受到管控机构严格的纯度、功效和安全标准的审查。rAAV需要在整个纯化过程中尽可能维持病毒活性完整。考虑到细菌颗粒复杂而敏感的构架，科学家们研发了许多下游处理策略。因此，重要的是要考量更多用于分离的rAAV的生物物理性质。
图5基于RAAV特性的下游加工策略
药物的基本要素是安全性、稳定性和有效性，基因药物也不例外。对于新药的调查，美国饮料药品监督管理局制定了指导文件，描述了一种渐进的制造控制方式。2005年，科学家非常了腺病毒和rAAV中的层析纯化步骤，并强调这种方式适用于大批量临床级载体生产。玛丽亚·梅赛德斯·塞古拉表示，AAV病毒的性质与纯化方式有关，但对AAV与规模纯化的详细特征的全面叙述仍在期待。了解AAV病毒的性质可能有助于选取更好的纯化方式，以取得影响下游处理选择的长期载体，特别是针对可扩展纯化。
病毒载体下游加工的主要挑战
病毒载体下游加工的主要挑战是怎样从构架上紧密相关的杂质如空衣壳中分离载体。尽管空颗粒在基因治疗中起着重要功效，但一些残留的空颗粒可能抑制衣壳特异性T细胞反应。空颗粒与同样的衣壳共享蛋白质结构，但他们不包括或极少包含基因组。它们可以借助两轮或四轮CSCL超速离心分离。
图6二轮CSCL密度梯度超速离心纯化rAAV病毒
与多肽质或抗原杂质相比，空颗粒更难分离。由于衣壳蛋白中VP3的品质较高，所有AAVs空衣壳的PI值平均约为6.3。AAV衣壳包装基因组(PIF)（约4.7kb)的平均PI值约为5.9。当溶液pH值大于PIE时，应选择AEX。随着离子密度的降低，空粒子将比封装的rAAV更早被洗脱。
现在，一步纯化的方式很难获取足够纯净的rAAV载体以满足临床必须。一般应该二步层析。第一步成为捕获层析从原料中捕获rAAV。第二步成为分离层析，从洗脱液中分离rAAV。已报道了同样或不同类型的层析串联组合，如AC与AEX、AEX与CEX、IEX与HIC或SEC、Diam、磷灰石与CEX、HIC或SEC。
针对捕获阶段，选择适合的结合和洗脱缓冲液应基于下述考虑
1.当带有载体的溶液通过时，介质与rAAV具有适合的结合和洗脱能力。不应该太严格的结合、洗涤和洗脱条件。
2.当扩大到制造规模时，介质具有更高的速度。
3.介质必须很好结合rAAV的能力。
4.在纯化过程中带有耐高压能力。
5.介质成本。
捕集阶段后大部份污染物被去除，二次层析的目的是受到更纯净的载体。与捕获色谱不同，色谱有更多的选取。第二种色谱介质选取的方法是基于两个特点：
1.柱效：它指的是色谱柱保留某一化合物而不使其扩散的能力。理论塔板高度和理论塔板数决定了柱的强度。色谱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低，色谱柱的柱效越好。
2.分辨率：分辨率对于推动满意的缓解方案是很重要的。目标峰和相邻峰需要分离。这种分离依赖于载体性质和固定相和流动相的选择性。
结论
重组腺相关病毒（rAAV）载体已变成最通用和最成功的基因治疗递送载体之一。FDA批准的适用于临床实验的rAAV产品研发工艺依赖于商业规模的工艺。优化的上下游研发工艺消除了rAAV载体生产对人类治疗研究和中药制备的难题。未来成熟高效的上下游研发策略有望实现以AAV载体为基础的基因治疗新时代的到来。
参考资料
[1]【动脉网】基因诊断——从根治疗，未来已来
[2]】全球CGT基因载体行业市场研究报告（2022-2026）
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